金雀异黄素的抗肿瘤及与辐照联合效应作用机制的研究

【摘要】研究背景：大豆异黄酮是富含于大豆中的植物雌激素，其中金雀异黄素（Genistein）生物活性最强。体内外研究均证实大豆异黄酮能减少激素依赖性肿瘤乳腺癌和前列腺癌发病率，是一种很有前景的防治癌症的天然化学物质。已知激素替代疗法有助于降低绝经女性结肠癌的发病风险，因此开展对植物雌激素的大豆异黄酮在结肠癌中的防治作用的研究具有重要的意义。另外，作为肿瘤的放射治疗在临床上可联合应用手术、化学或激素治疗，为了提高局部控制以及生存期，放疗联合放射增敏试剂是一种针对癌症的有效的治疗方法，大豆异黄酮在其中所起的作用也值得关注。目的：研究大豆异黄酮对结肠癌和乳腺癌的抗癌作用及大豆异黄酮对结肠癌和乳腺癌的辐射增敏作用。方法：细胞株选用人结肠癌细胞HCT-116和乳腺癌细胞MDA-MB-468，细胞于DMEM培养基中常规培养传代。除非特别交代，金雀异黄素的实验浓度定为0、25、50和100μmol/L。采用MTT法测定细胞存活率、流式细胞术分析细胞周期的分布、Westernblot法测定相关蛋白的表达、磷脂酰丝氨酸外翻法（AnnexinV-PI双染法）分析金雀异黄素对细胞凋亡的影响；细胞内ROS的影响（DCF法）和线粒体膜电位的变化（JC-1法）采用试剂盒检测；采用透射电镜下观察细胞超微结构的改变；金雀异黄素对肿瘤细胞的侵袭转移的影响，采用Transwell实验、细胞粘附性实验以及免疫荧光法测定E-钙粘附蛋白（E-cadherin）和基质金属蛋白酶（MMP2）的变化进行研究。金雀异黄素对肿瘤细胞放射敏感性的初步研究选用无毒性25μmol/L的金雀异黄素处理细胞，联合X射线对细胞进行辐照。采用克隆形成实验计算细胞存活分数、流式细胞术检测细胞周期和细胞的凋亡、并用Westernblot法进一步检测金雀异黄素预处理对照射后细胞内DNA损伤修复相关蛋白表达的调节作用。结果：1.结肠癌HCT-116(1)金雀异黄素对HCT-116细胞增殖有明显的抑制作用，并呈浓度和时间依赖关系，抑制50%细胞生长的剂量（IC50）为123.8μmol/L（24h）。0、25、50和100μmol/L金雀异黄素处理后出现了明显的G2/M的周期阻滞，细胞数量从18.11±1.36%增至32.7±0.04%。进一步的机制研究发现，金雀异黄素处理降低了细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinH表达，对CylinD3、CyclinA、CyclinE的表达无明显影响。(2)金雀异黄素处理HCT-116细胞后，AnnexinV/PI双染法结果显示早期凋亡细胞比例随浓度增加而上升，晚期凋亡细胞也略有增多。特征性的Sub-G1凋亡峰随处理浓度的增加而增多。100μmol/L金雀异黄素处理2h后细胞内ROS水平达峰值，为处理前的1.81倍（15.53±1.55%vs8.57±0.35%），然后逐渐下降。100μmol/L金雀异黄素处理1h后线粒体膜电位迅速下降了87.8%，以后虽略有回升，但维持在极低的水平。与凋亡相关的P53蛋白出现升高，并且抑凋亡蛋白Bcl-2出现了下调，促凋亡蛋白Bax出现了上调。透射电镜下，金雀异黄素处理后细胞呈现不同程度的凋亡和自噬性改变。(3)100μmol/L金雀异黄素处理8h后细胞粘附性为81.32±3.26%，对照组为97.31±7.68%，即金雀异黄素显著降低粘附能力。Transwell结果显示0、25、50μmol/L金雀异黄素处理后转移细胞数分别为567.67±50、407±15.58、63.33±11.15，即侵袭转移能力逐步下降。荧光显微镜下100μmol/L金雀异黄素处理后细胞质中E-cadherin荧光强度变强，MMP2抗体荧光强度变弱。2.乳腺癌MDA-MB-468细胞(1)金雀异黄素对MDA-MB-468细胞增殖也有明显的抑制作用并具有浓度和时间依赖关系，IC50为70.8μmol/L（24h）。0、25、50μmol/L金雀异黄素处理后G2/M期细胞数量从10.04±0.74%增至50.21±1.47%，100μmol/L时减至19.55±7.13%，表明低浓度时（<50μmol/L）引起G2/M期阻滞。(2)AnnexinV/PI双染法分析显示100μmol/L金雀异黄素处理后晚期凋亡细胞有所增加。特征性的Sub-G1凋亡峰随着处理浓度的增加而增多。100μmol/L金雀异黄素处理后2h，ROS水平是处理前的1.44倍(84.8±2.69%vs58.93±0.67%)，然后逐渐下降。100μmol/L金雀异黄素处理1h后细胞线粒体膜电位迅速下降了93.7%（16.03±0.52%vs1.01±0.20%,P<0.01），以后维持在极低的水平。透射电镜下，处理后细胞也呈现不同程度的凋亡性改变。(3)100μmol/L金雀异黄素处理6h后细胞粘附性为93.45±0.90%，显著低于对照组的99.21±0.58%。Transwell结果显示0、25、50μmol/L金雀异黄素处理后转移细胞数分别为546.33±20.07、449.67±14.38、305.67±8.06，提示侵袭转移能力明显下降。荧光显微镜下，100μmol/L金雀异黄素处理后细胞质中NF-κB抗体荧光强度稍变弱，细胞质中E-cadherin抗体荧光强度变强、MMP2抗体荧光强度变弱。3.联合照射作用在人结肠癌HCT-116细胞中，与单纯照射组6Gy组比较，25μmol/L金雀异黄素预处理照射联合组，能明显减少照射后的细胞克隆形成数，其放射增敏比为1.204。细胞周期的结果显示25μmol/L金雀异黄素与6Gy辐射联合后G2/M期细胞上升至35.74±3.25%，与单纯照射组26.26±2.19%相比有明显升高。特征性的Sub-G1凋亡峰，单纯照射组为：5.25±0.8%，联合组为10.89±0.24%。机制研究发现金雀异黄素与辐射联合较单纯照射组比DNA损伤修复蛋白Ku80、Mre11和XRCC4的表达出现了明显下调。同样在乳腺癌MDA-MB-468细胞中，25μmol/L金雀异黄素与6Gy辐射联合组和6Gy照射组的G2/M期细胞分别为82.41±2.44%和24.08±2.87%，发现金雀异黄素预处理能够明显引起细胞G2/M期周期阻滞。特征性的Sub-G1凋亡峰，单纯照射组为：7.24±0.68%，联合组为13.3±0.74%。但是，在MDA-MB-468细胞的Ku80、XRCC4、Mre11蛋白水平无明显差异。结论：1.金雀异黄素能够抑制结肠癌HCT-116和乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖，并呈浓度依赖和时间依赖。金雀异黄素诱导了这两种肿瘤细胞的G2/M期周期阻滞。诱导细胞内ROS的产生，从而引起线粒体膜电位的降低诱导细胞凋亡。2.其抗肿瘤的作用机制可能是金雀异黄素能够下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax等的表达诱导了细胞的凋亡，引起细胞周期蛋白的改变，诱导了细胞的G2/M期的周期阻滞。抑制肿瘤的侵袭及转移能力与调节钙粘附蛋白和基质金属蛋白酶有关。3.金雀异黄素能够增加结肠癌HCT-116和乳腺癌MDA-MB-468细胞的放射敏感性，金雀异黄素预处理细胞的凋亡和G2/M期有明显增加。其机制：在结肠癌HCT-116细胞中可能与调节DNA损伤修复蛋白有关，而在MDA-MB-468细胞中没有发现，这里可能与肿瘤细胞的类型有关，确切的机制尚需进一步研究。
【作者】吴晶；
【导师】秦立强；
【作者基本信息】苏州大学，营养与食品卫生学，2014，硕士
【关键词】大豆异黄酮；金雀异黄素；结肠癌；乳腺癌；细胞周期；细胞凋亡；侵袭转移；放射敏感性；

【参考文献】
[1]赵小兰.论我国诉调对接机制的运行现状及完善[D].华东政法大学,法律,2012,硕士.
[2]俞苗.不同学科学术语篇中四词词块的研究[D].大连海事大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[3]王秦玮.对外汉语教学中的颜色词教学研究[D].兰州大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[4]华军.北京瑞普韦尔仪表有限公司营销策略研究[D].对外经济贸易大学,工商管理,2004,硕士.
[5]祝锐.蚁群算法在电力系统PMU优化配置中的应用[D].湖北工业大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[6]郭晓良.打造环北京职业公路自行车赛品牌赛事的研究[D].首都体育学院,体育教育训练学,2013,硕士.
[7]高杨.《鼓掌绝尘》代词研究[D].曲阜师范大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[8]徐英吉.我国货币政策信贷传导机制有效性研究[D].青岛大学,金融学,2004,硕士.
[9]李传生,张春熹,王夏霄,于佳,冯秀娟.反射式Sagnac型光纤电流互感器的关键技术[J].电力系统自动化,2013,12:104-108+127.
[10]武海潭.体育课不同运动负荷组合方式对少年儿童健康体适能及情绪状态影响的实验研究[D].华东师范大学,运动人体科学,2014,博士.
[11]洪丽姬.铂基直接甲醇燃料电池阳极催化剂的制备、表征及电催化性能研究[D].浙江师范大学,2014.
[12]王丽佳,贾松敏,李秀智,王爽.基于改进在线多示例学习算法的机器人目标跟踪[J].自动化学报,2014,12:2916-2925.
[13]陈仲良,姚俊玲,董绍春,冯杰.以烷氧基硅烷溶胶-凝胶技术制备纳米ATO透明隔热涂层[J].化工新型材料,2014,08:52-54.
[14]尹文静.TRISO包覆燃料颗粒放射性核素的产生及安全性分析[D].中国科学院研究生院（上海应用物理研究所）,粒子物理与原子核物理,2014,硕士.
[15]闫虎民.基于模糊自整定PID的直流电机调速系统研究[D].天津大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[16]赵万梅.《铺平大道通长安》艺术塑造与音乐表现[D].内蒙古师范大学,音乐学,2013,硕士.
[17]杨正飞.老年人服务的网络供给方式研究[D].首都经济贸易大学,社会保障学,2013,硕士.
[18]朱传忠.土耳其正义与发展党及其执政实践研究[D].西北大学,世界史,2014,博士.
[19]徐训鑫.当代纤维艺术的设计语言研究[D].西安美术学院,设计艺术学,2014,硕士.
[20]周博.脑瘫青少年上、下台阶的运动生物力学特征研究[D].鲁东大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[21]唐功友,张洪云,李超.具有控制时滞系统的最优无静差正弦扰动抑制[J].控制与决策,2007,07:817-820.
[22]周昌松.基于管理信息系统的牵引变压器状态检修策略研究[D].西南交通大学,电力系统及其自动化,2014,硕士.
[23]刘岭.我国金融业经营模式研究[D].江西财经大学,金融学,2004,硕士.
[24]林盼.清末新式媒体与关系网络[D].复旦大学,中国古代史,2013,博士.
[25]单富兴.大规模环境污染侵权的剖析与赔偿机制研究[D].首都经济贸易大学,民商法学,2014,硕士.
[26]王振华,夏庆龙,田立新,周滨,刘春城.消除海底电缆双检地震资料中的鸣震干扰[J].石油地球物理勘探,2008,06:626-635+606+742.
[27]陈彤.胰岛素/PLGA缓释微球的研究[D].河北科技大学,制药工程,2014,硕士.
[28]葛士彬.石墨烯、石墨烯/碳纳米管的制备及其超级电容器性能研究[D].哈尔滨工业大学,2009.
[29]邓阳杰.宫地嘉六文学作品中劳动者形象研究[D].华中师范大学,日语语言文学,2013,硕士.
[30]汤旭.高铁高架车站候车厅声场预测及降噪方法研究[D].哈尔滨工业大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[31]文海燕.储罐底板缺陷漏磁检测数据可视化软件系统[D].湖北工业大学,精密仪器及机械,2013,硕士.
[32]沈国辉,李立新,狄方春,孟鑫,刘金波,高宝成.特高压电网调度自动化系统的数据集成和可视化展示[J].电力系统自动化,2009,23:94-97.
[33]严玉.一个基于统计技术的苏州市自来水公司数据挖掘系统[D].苏州大学,2003.
[34]张兴.基于专家系统的计算机网络故障管理系统[D].辽宁工程技术大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[35]吴冲.玻璃纤维/聚脲复合材料的微观结构与力学性能研究[D].哈尔滨工业大学,材料学,2013,硕士.
[36]汪荣贵,张佑生,王浩,胡学钢.分组样本下先验BN模型及条件概率的学习算法[J].微电子学与计算机,2002,05:1-3.
[37]吴杨梅.城镇化视角下景郊型乡村旅游地发展模式研究[D].华侨大学,人文地理学,2014,硕士.
[38]陈建英.D公司供应链金融风险控制策略研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[39]武文雯.中国高等教育质量评估研究[D].吉林大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[40]王学文.企业内部控制基本规范在汉德车桥公司体系构建中的应用研究[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[41]刘洋.基于模糊出行需求的交通分布与分配组合模型研究[D].哈尔滨工业大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[42]王莎莎.基于超薄绝热保温板的粘结砂浆配方优化与性能研究[D].山东建筑大学,结构工程,2013,硕士.
[43]钟里卉.城镇污水处理项目的公众价值研究[D].武汉纺织大学,企业管理,2014,硕士.
[44]王丽萍.车辆荷载等级提高对T梁主要材料费用的影响研究[D].重庆交通大学,管理科学与工程,2011,硕士.
[45]龙亚东.FOXE-1甲基化与表达的关联分析及其与结直肠癌的相关性研究[D].复旦大学,肿瘤学（专业学位）,2013,博士.
[46]程文霞.中学语文教学课堂氛围研究[D].华中师范大学,学科教育,2013,硕士.
[47]万晓航.火电厂生产成本动态监测及竞价上网辅助决策系统[D].华北电力大学（北京）,机械设计及理论,2004,硕士.
[48]马浩剑.武进经发区在全省上升15位[N].常州日报,2012-01-30A01.
[49]于仲山.管理贵在创造提倡创造管理[J].发电设备.1990(01)
[50]李树华.数据仓库的星型解决方案及其实验研究[D].吉林大学,2004.